Retningslinjer for arbeid med retrovirus
Retrovirus
Et virus som har RNA som arvestoff kalles et retrovirus. RNA-genomet inneholder et gen som koder for enzymet revers transkriptase. Etter at retroviruset har infisert en celle, brukes enzymet til å kopiere RNAet om til DNA. Dette DNAet blir så spleiset sammen med cellens eget DNA, og på den måten tvinges cellen til å lage nye virus. Det finnes en spesiell variant av retrovirus som aldri forlater cellen den har infisert, men i stedet blir permanent innlemmet i denne cellens genom. Slike retrovirus kalles endogene, og er et nyttig verktøy i biomedinsk forskning.
Retrovirus kan brukes til å transportere gener av interesse inn i ulike celletyper (infeksjon). Men disse virusene er da mutert i aktuelle gener som gjør at de ikke kan replikere/formere seg, og dermed bare kan infisere celler en gang (en livssyklus). Noe som vil hindre dannelse og spredning av replikasjonsdyktige retrovirus. De har vanligvis defekt pakkesignal eller defekt pakkesignal og 3`LTR slik at en trippel rekombinant begivenhet mellom vektor, eventuelle endogene sekvenser og hjelpevirus må til for å få dannet replikasjonsdyktige ”selvstendige” viruspartikler. En slik begivenhet er ennå ikke påvist, men til tross for dette bør vi ta visse forhåndsregler når vi jobber med retrovirus.
Typer retrovirus
Ecotrope retrovirus
Infiserer celler som utrykker den ecotropiske reseptoren, et murint stort transmembrant protein som gjenkjenner det retrovirale kappe-proteinet (envelope protein) til Moloney murin leukemia virus (MMLV). De fleste murine og rotte-celler utrykker denne reseptoren og er derfor i stand til å bli infisert av virus med dette kappeproteinet.
Ecotrope retrovirus er per definisjon ikke i stand til å infisere mennesker. Men alt arbeid med et ecotrope virus med et farlig gen eller ukjent virus skal behandles som amfotrope retrovirus.
Amfotrope retrovirus
Infiserer mammalske celletyper. Dette inkluderer humane celler og krever bruk av retrovirale virus som inneholder amfotrope kappeproteiner (envelope protein). Lentivirale vektorer er basert på HIV viruset og er et eksempel på amfotrope retrovirus som brukes mye som virale vektorer i forskning. Ettersom amfotrope virus, per definisjon er i stand til å infisere humane celler og integreres i genomet, må man utvise ekstra forsiktighet ved arbeid med disse virale vektorene. Cellekulturarbeid som involverer amfotrope retrovirus er derfor potensielt farlig, dette gjelder særlig bruk av vektorer som inneholder proto-onkogener og patologi-relaterte gener. I verste fall kan brukere av slike virale vektorer få kreft eller annen sykdom ved å bli eksponert for disse rekombinante retrovirusene. Enkle, men strenge forhåndsregler kan forhindre at du og de rundt deg blir eksponert for denne potensielle faren. I tillegg bør man regelmessig sjekke retrovirusenes evne til å replikere for å forsikre seg om at de ikke kan spre seg.
Ved bruk av lentivirus er det en fordel om brukerne tilstreber å benytte 3.generasjons lentivirale vektorer. 3.generasjons lentivirale vektorer er sikrere for brukerne ved at de essensielle genene som er nødvendige for å lage et ikke replikasjonsdyktig lentivirus er pakket i tre separate plasmider, dette vil igjen medføre en mindre risiko for at replikasjonskompetente retrovirus dannes.
Krav til rom og utstyr
For arbeid med retrovirus skal cellelab med biosafety nivå 2 eller høyere benyttes (BSL2, BSL 2+ eller BSL3). Dersom det er tilgjengelig, er et rom med undertrykk foretrukket for arbeid med retrovirus. UV-lys i laf-benken og i taket er også en fordel, og benyttes etter arbeid med retrovirus i cellelaben.
Laf-benken
Alt arbeid med retrovirus skal foregå i laminar flow skap med utsugingsfilter/ HEPA-filter. En egen virus-inkubator skal benyttes. Arbeidsbenken skal dekontamineres med 70% etanol før og etter bruk, og minst en gang daglig og med en gang etter en har sølt. Ved søl skal også platene i benken løftes opp, og alle flatene i benken dekontamineres med etanol. Etter arbeid vil benken vaskes med 70% etanol. Luften i kabinettet skal ”dusjes” med 70% etanol for å fjerne eventuelle viruspartikler i sirkulasjonen. Deretter settes UV-lys på i laf-benken.
Infisert materiale
Alt infisert materiale, medium og celler, blir samlet i egne lukkede flasker/beholdere og dekontaminert med 25% kloramine, (et egnet alternativ er 1% Virkon), i opptil 24 timer inne i arbeidsbenken. Beholderen blir sprayet med 70% etanol før den blir tatt ut fra benken og over i spesialavfalls-kartonger («de gule boksene») som sendes til forbrenning. Ved bruk av vakum-pumpe på infiserte celler og medium; sørg for at det ikke er noe medium igjen i slangen og hold alltid enden inne i arbeidsbenken inkubert i 70% etanol når den ikke er i bruk. Skyll slangen med 70% etanol etter bruk. Avfall fra dunken autoklaveres. Etter autoklavering behandles avfallet fra kolben som vanlig avfall fra cellelaben.
Utstyr
Før du starter, vær sikker på at du har de følgende tingene i arbeidsbenken eller innen armlengde; spruteplaske med 70% etanol, flaske med 25% kloramine, avfallspose, nødvendige pipetter, bøtte med 25% kloramine og annet nødvendig utstyr (medie, PBS, celleflasker osv).
Kun engangsutstyr (plastikk) benyttes til infisert materiale. Alle pipetter, spisser, rør og lignende som har vært i kontakt med retrovirus skal behandles med 25% kloramine før det dekontamineres i 25% kloramine i 24 timer. Dersom avfallet må tas ut av laf-benken umiddelbart etter skylling i kloramine-løsningen, legges avfallet i en egen autoklavpose som forsegles inne i arbeidsbenken. Denne avfallsposen sprayes med 70% etanol før den tas ut fra arbeidsbenken og plasseres i «de gule boksene» som går til forbrenning.
Kontaminerte nåler desinfiseres i 25% kloramine, og kastes deretter i egen plast-sikkerhetscontainer. Hvis man må bruke flergangsutstyr skal dette sprayes med 25% kloramine (eller 1% virkon), la virke i 2 minutter og tørk av. Deretter autoklaveres utstyret.
Fysisk beskyttelse
Ved arbeid med retrovirus skal en bruke munnbind, hette, hansker og egen laboratoriefrakk med lukking på ryggen. Hanskene kastes i «de gule boksene» som går til forbrenning og hendene vaskes grundig når en forlater rommet. Dørene til cellelaboratoriene skal alltid være lukket. Før du forlater cellelaboratoriet skal alle hansker, ansiktsmaske og frakk fjernes. Ved arbeid med amfotrope retrovirus skal en i tillegg jobbe med doble sett med hansker. Nitrile-hansker er å foretrekke til dette formålet. Etter endt arbeid skal det ytre hanskeparet kastes i en autoklavpose i arbeidsbenken som beskrevet over, og posen skal deretter sendes til forbrenning i «de gule boksene».
Kontroll av replikasjonsdyktige retrovirus
Better safe than sorry!
Retrovirusene bør regelmessig kontrolleres for å hindre dannelse og spredning av replikasjonsdyktig retrovirus. Mediet fra sekundærkulturer (dvs transfekterte celler) brukes til å transfektere 3T3 celler. Disse cellene selekteres så for en aktuell seleksjonsmarkør (vanligvis G418). Medium fra de transfekterte 3T3-cellene screenes deretter for reverse transkriptase (bruker et revers transkriptase assay). Hvis noe er uklart eller uforståelig, ikke nøl med å spørre.
Dersom BSL3 lab benyttes til arbeid med retrovirus, er det ikke ønskelig at det arbeides med replikasjonskompetente virus og genmodifiserte vektorer som er kompatible med de replikasjonskompetente virus i laboratoriet. Dette for å unngå dannelse av replikasjonsdyktige genmodifiserte virus.
For generelt cellearbeid og BSL2/3 arbeid, se Celle/vevkultur.